آنالیز شیمیایی و مولکولی تبلور عسل

یون ما،بینگ ژانگ،هونگیان لی،یولو لی،جیانگینگ هو،جینگ لی،هونگمینگ وانگ و زیوان دنگن

مقدمه

عسل، محلول قندی بسیار چسبناک، یک ماده شیرین طبیعی است که توسط زنبورها تولید می شود.  عسل به دلیل ترکیبات مغذی آن مانند فروکتوز، گلوکز، ساکارز، مالتوز، آنزیم‌ها، اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و مواد معدنی مورد توجه روزافزونی قرار گرفته است. ^2-4 برای مثال، فروکتوز، که در عسل فراوان است، به دلیل عملکرد ملین آن، یبوست را بهبود می‌بخشد ⁵.

عسل تازه برداشت شده معمولاً به صورت مایع است. غالباً فوق اشباع شده و مستعد تبلور است، با سرعتی که عمدتاً تحت تأثیر حضور دانه های هسته، درجه فوق اشباع و ویسکوزیته است که با دمای محیط مرتبط است[6، 7].

برخی از عسل های تک گل (مانند مرکبات) به طور طبیعی ریز و همگن متبلور می‌شوند، در حالی که برای اکثر عسل‌های تجاری، کریستال درشت ناخواسته ناشی از دانه‌بندی خود به خودی کیفیت پایینی در نظر گرفته می‌شود که به جدایی فاز، رسوب‌گذاری یا فعالیت آب افزایش می‌یابد تا سطوحی که ممکن است برای رشد میکروبی مناسب باشد افزایش یابد[8، 9].

علاوه بر این، قندها، به ویژه گلوکز و فروکتوز، به عنوان مواد اولیه موجود در عسل، نقش مهمی در تبلور دارند[10]. به دلیل حلالیت کمتر، اعتقاد بر این است که گلوکز قند متبلورکننده است[11].

گزارش شده است که گلوکز خالص ممکن است به صورت مونوهیدرات آلفا-دی-گلوکز با فرم کریستالی پایدار در دمای زیر 50 درجه سانتیگراد، به عنوان شکل بی آب آلفا - دی گلوکز پایدار بین 50 تا 80 درجه سانتیگراد و به عنوان فرم بتا-دی-گلوکز پایدار بی آب در دمای بیش از 80 درجه سانتیگراد متبلور شود [12، 13].

  دوبری و همکاران [14] همچنین دریافتند که پدیده کریستالیزاسیون با نسبت گلوکز به فروکتوز در عسل ارتباط نزدیکی دارد. اما مشخص نیست که چه نسبت بحرانی گلوکز به فروکتوز منجر به تبلور عسل می شود. اگرچه تبلور عسل به صورت تجربی توسط بسیاری از گروه‌های تحقیقاتی مورد مطالعه قرار گرفته است، هیچ روش تجربی مناسبی برای توضیح این مکانیسم تبلور در سطح مولکولی عمیق موجود نیست.

شبیه‌سازی دینامیک مولکولی (MD) یک ابزار محاسباتی قدرتمند است که بر اساس گزارشات راهکاری حیاتی برای بررسی نظری چنین پدیده‌ای در سطح مولکولی است. شبیه‌سازی‌های مولکولی پویا(دینامیک) محاسباتی می‌توانند به توضیح مشاهدات در آزمایش کمک کنند. این شبیه‌سازی نه تنها اطلاعات موجود قابل اصلاح برای آزمایش را فراهم می‌کنند، بلکه حتی پیش‌بینی دقیق خواص فیزیکی سیستم‌های واقع‌گرایانه را نیز ارائه می‌کنند. بنابراین، به طور گسترده توسط بسیاری از محققان به عنوان یک ابزار ارزشمند برای مطالعات موجود آنها استفاده شده است. [ 15-17 ] یائو و همکاران  [ 18 ]برهمکنش بین بتا سیکلودکسترین و مولکولی نشاسته با استفاده از روش شبیه سازی MD بررسی کردند. آنها به این نتیجه رسیدند که بتا سیکلودکسترین می تواند با برهمکنش با مولکولی نشاسته از طریق پیوند غیرکووالانسی، رتروگراسیون نشاسته را در برنج مهار کند. در مطالعه حاضر، شبیه‌سازی MD برای درک تبلور عسل معمولی چینی بر اساس ترکیبات قند تعیین‌شده در اشکال مختلف عسل انجام شد. با توجه به دانش ما، این اولین مطالعه بر روی شبیه‌سازی MD برای بررسی تبلور عسل است.

خرید عسل طبیعی

بهترین عسل‌های ایران را در هانی‌هاب بیابید. خرید عسل

مواد و روش‌ها

برای مشاهده بخش مواد و روش‌ها مقاله انگلیسی را مطالعه کنید.

نتایج و بحث

ترکیب شکر

کروماتوگرافی HPLC استانداردهای شکر مخلوط (گلوکز، فروکتوز، ساکارز و مالتوز) و عسل‌ها به شکل مایع، کریستال و مخلوط در شکل 1 نشان داده شده است. چهار ترکیب قند شامل گلوکز، فروکتوز، ساکارز و مالتوز در هر سه شکل عسل شناسایی شد. گلوکز و فروکتوز، که به عنوان دو قند اصلی در عسل شناسایی شدند، تقریباً غلظت‌های مساوی داشتند، در حالی که ساکارز و مالتوز در مقادیر بسیار کمی وجود داشتند. میزان قند موجود در عسل در جدول 1 نشان داده شده است. محتوای گلوکز و فروکتوز به ترتیب از 26.4 تا 43.3 گرم در 100 گرم و 18.4 تا 27.2 گرم در 100 گرم بود و تفاوت معنی داری (0/05 andgt; p) را در بین اشکال مختلف عسل نشان داد. عسل رس بسته دارای بیشترین مقدار گلوکز (43.3 گرم در 100 گرم) و کمترین غلظت فروکتوز (18.4 گرم در 100 گرم) بود، در حالی که عسل مایع بالاترین غلظت فروکتوز (27.2 گرم در 100 گرم) و کمترین غلظت غلظت گلوکز (26.4 گرم در 100 گرم) را داشت. این نتایج نشان داد که غلظت گلوکز و فروکتوز می‌تواند به طور قابل توجهی بر تبلور عسل تأثیر بگذارد. با توجه به ادبیات، برخی از شاخص‌ها بر اساس محتویات قندها نیز با تمایل کریستالیزاسیون همراه بوده‌اند. 

توسی و همکاران [ 26 ]مشاهده کرد که نسبت فروکتوز/گلوکز 1.14 یا کمتر در عسل نشان دهنده تبلور سریع در عسل‌های اروپایی است، در حالی که مقدار نسبت بیش از 1.58 نشان دهنده عدم تمایل به کریستالیزه شدن است.

 به طور کلی، نسبت گلوکز به فروکتوز در عسل می‌تواند به طور قابل توجهی تحت تاثیر انواع عسل و محل مبدا قرار گیرد. به عنوان مثال، ماریسول و همکاران [27] نشان داد که نسبت گلوکز به فروکتوز عسل های اقاقیا 1:1.5 در اسپانیا، 1:1.7 در رومانی و 1:1.59 در جمهوری چک است، در حالی که نسبت گلوکز به فروکتوز عسل های آفتابگردان 1:1.3 در اسپانیا، 1:1.7 است. در رومانی و 1:1.1 در جمهوری چک بود. در مطالعه حاضر، نسبت گلوکز به فروکتوز بین اشکال مایع، مخلوط و رس بسته عسل معمولی چینی تفاوت معنی‌داری نشان داد که به ترتیب 1:1، 2:1 و 2.5:1 تعیین شدند. این نتیجه بیشتر ثابت می کند که نسبت گلوکز/ فروکتوز یک شاخص مهم برای تبلور در بین نمونه های مختلف عسل است. 

شکل 1. کروماتوگرام HPLC از استانداردهای مخلوط قندها (گلوکز، فروکتوز، ساکارز و مالتوز) و عسل به صورت مایع، کریستال و مخلوط. پیک 1، 2، 3 و 4 به ترتیب نشان دهنده فروکتوز، گلوکز، ساکارز و مالتوز است.

تجزیه و تحلیل مورفولوژی کریستال توسط ESEM

برای درک بهتر ریزساختار آنها، کریستال های عسل و گلوکز خالص با استفاده از ESEM تجسم شدند. شکل 2a و 2b به وضوح نشان داد که مورفولوژی کریستال عسل نامنظم با لبه صاف است. با این حال، کریستال گلوکز دارای مورفولوژی صفحه مانند با لبه صاف بود ( شکل 2c و 2d ). این نتایج نشان می دهد که این احتمال وجود دارد که ترکیب قند نقش مهمی در تشکیل کریستال پایدار عسل داشته باشد.

شکل 2. تصاویر SEM از کریستال عسل (a و b) و گلوکز (c و d). بزرگنمایی a، c و b، d به ترتیب 1500 و 3000 برابر بود.

شبیه سازی ملکولی پویا

برای درک بهتر مکانیسم مولکولی بالقوه تبلور در عسل، شبیه‌سازی MD را برای بررسی این پدیده در سطح مولکولی انجام دادیم. نسبت های فوق (1:1، 2:1 و 2.5:1) نشان داد که قندها بخش عمده عسل را تشکیل می دهند.میز 1و اعتقاد بر این است که غلظت گلوکز و فروکتوز به طور قابل توجهی بر فرآیند تبلور عسل تأثیر می گذارد. بنابراین، نسبت های گلوکز / فروکتوز در 1: 1، 2: 1، و 2.5: 1 برای شبیه سازی MD به تصویب رسید. شبیه سازی MD کریستال گلوکز خالص به عنوان شاهد استفاده شد. سپس ما تغییرات RMSD، Rg، SDSA و ΔE را در بین کریستال‌های عسل با نسبت‌های مختلف گلوکز/فروکتوز بررسی کردیم.

شبیه سازی MD برای تجزیه و تحلیل تغییر ساختاری رشد کریستال انجام شد. شکل 3 تصاویر فوری پیکربندی مولکولی را در طول تبلور عسل با نسبت گلوکز/فروکتوز در 2.5:1 نشان می دهد. مولکول های قند نامنظم در ابتدا در سیستم توزیع شدند و تعدادی هسته بلوری به تدریج در هسته فاز آمورف از فاز آمورف تشکیل شدند. درشت شدن دانه را می توان به وضوح مشاهده کرد. پس از رشد جنین‌های کریستالی، ساختار بلوری منظم که در مورفولوژی مکعبی بود، در نهایت شکل گرفت. در مطالعه ما، هر چهار مدل شبیه‌سازی شامل نسبت گلوکز/فروکتوز در 1:1، 2:1، 2.5:1 و گلوکز خالص می‌توانند بلورهای پایداری را در پایان شبیه‌سازی تشکیل دهند، اما در زمان شکل‌گیری متفاوت هستند. فاز کریستالی پایدار که درجدول 2 منهای انرژی برهمکنش الکترواستاتیک (ΔE ele ) و انرژی برهمکنش واندروالس (ΔEvdw) نشان دهنده انرژی جذب است. نسبت گلوکز/فروکتوز در 2:1 دارای بالاترین مقدار مطلق ΔE vdw در بین هر چهار مدل است (0/05andgt; p) و پس از آن نسبت گلوکز/فروکتوز در 1:1 قرار دارد که به طور قابل توجهی بزرگتر از نسبت گلوکز/فروکتوز در 2.5 است: 1 و کریستال گلوکز خالص ( p andlt;0.05). با این حال، کریستال گلوکز خالص دارای بالاترین انرژی برهمکنش الکترواستاتیکی (ΔE ele ) مقدار مطلق (-9297.20 kcal/mol، pandlt;0.05) در بین هر چهار مدل، و سپس کریستال عسل با نسبت گلوکز/فروکتوز در 2.5:1 (-6170.56 کیلوکالری در مول)، 2:1 (-6120.64 کیلوکالری در مول)، و 1:1 (-5944.04 کیلو کالری در مول) ). با کاهش مقدار مطلق ΔE ele ، مقدار Rg و SASA به طور همبسته افزایش یافت، که به معنی فشردگی کریستال عسل کاهش یافت. 

ما می‌توانیم استنباط کنیم که انرژی برهمکنش الکترواستاتیکی بود که مولکول‌های قند را جمع‌آوری کرد تا پیکربندی منظم کریستال را در شکل 3 تشکیل دهد. بنابراین، این موضوع تأیید می‌کند که گلوکز سهم نسبتاً قابل توجهی برای انرژی برهمکنش الکترواستاتیک در فرآیند تبلور عسل دارد.

 دادن انرژی برهمکنش الکترواستاتیکی (ΔE ele) برای جمع آوری مولکول های قند برای تشکیل پیکربندی منظم کریستال مهم بود، ما نمودار ΔE ele مولکول های قند کریستال را در مقابل زمان در دمای 300 K، که در شکل 4d نشان داده شده است، بیشتر تجزیه و تحلیل کردیم . مشاهده شد که نمودار مقدار ΔE ele در بین تمام مدل‌های شبیه‌سازی بین بازه زمانی 0 تا 1000 ثانیه پایدار می‌ماند. مطابق با آن نتایج مشاهده شده درجدول 2قدر مطلق ΔE ele کریستال گلوکز خالص به طور قابل توجهی بالاتر از سایر مدل‌های عسل بود.

 این نتیجه نشان داد که کریستال گلوکز خالص با کریستال عسل متفاوت است که با نتیجه مورفولوژی کریستال مشاهده شده توسط ESEM مطابقت دارد. انرژی برهمکنش واندروالس (ΔE vdw ) و زمان تشکیل بلور نیز در این مطالعه محاسبه شد. همانطور که در نشان داده شده استجدول 2مدل c با نسبت گلوکز/ فروکتوز 2.5:1 کریستال پایداری را در 350 ps تشکیل داد که به طور قابل توجهی کوتاهتر از سایر مدل های شبیه سازی بود ( 0/05 andgt;p). علاوه بر این، نسبت در مقدار RMSD 2.5:1 (0.02 ± 5.29) به طور قابل توجهی کمتر از سه مدل دیگر ( 0/05 andgt;p ) بود، که به این معنی بود که مدل عسل در 2.5: 1 پایدارترین تبلور عسل بود. بنابراین، نسبت 2.5:1 احتمالاً نسبت بحرانی تبلور عسل بود.

شکل 3. عکس های فوری از فرآیند تبلور عسل با نسبت گلوکز/فروکتوز در 2.5:1 (مدل a) به دست آمده از شبیه سازی MD در آب.

شبیه سازی ملکولی داینامیک منجر به تولید نمودارهای مختلفی شد که در میان آنها نمودار RMSD است ( شکل 4a). ما RMSD را برای تمام مولکول‌های قند از پیکربندی اولیه تا نهایی محاسبه کردیم، که به عنوان یک معیار مرکزی برای اندازه‌گیری همگرایی کریستال موجود در عسل در نظر گرفته شد. مقدار RMSD ستون فقرات در فاز اولیه افزایش ناگهانی نشان داد و سپس برای مسیرهای چهار مدل شبیه‌سازی تا پایداری کاهش نوسانی داشت ( شکل 4a ). در شکل 4a ، شبیه سازی با نسبت گلوکز/ فروکتوز در 1:1 به طور قابل توجهی نوسان داشت و بیشترین مقدار RMSD را تا 23 نانومتر پس از 100 ثانیه نشان داد. مشاهدات روی نمودار مقدار RMSD در شکل 4aنشان داد که به طور متوسط، ساختار کریستالی تشکیل شده توسط نسبت گلوکز / فروکتوز در 2.5: 1 دارای قوی ترین ثبات به طور قابل توجهی، در مقایسه با سه مدل دیگر. در همین حال، نتایج ثابت ماندن مقادیر RMSD در پایان شبیه‌سازی برای تمامی مدل‌های شبیه‌سازی، نشان داد که شبیه‌سازی انجام شده در مطالعه حاضر می‌تواند مسیری پایدار ایجاد کند، بنابراین مبنای مناسبی برای تحلیل‌های بیشتر فراهم می‌کند.

شکل 4. منحنی های سیستم های شبیه سازی کریستال عسل را با نسبت گلوکز/ فروکتوز در 2.5:1، 2:1، 1:1 و کریستال گلوکز خالص در مقابل زمان در 300 K ترسیم کنید. (الف) تغییر ریشه میانگین مربعات (RMSD) سیستم های شبیه سازی. (ب) تغییر شعاع چرخش (Rg) سیستم های شبیه سازی. (ج) تغییر سطح سطح قابل دسترسی با حلال (SASA) در سیستم های شبیه سازی. (د) برهمکنش الکترواستاتیکی (ΔE ele ) سیستم های شبیه سازی.

Rg به عنوان میانگین وزنی ریشه فاصله مربع جمع آوری مولکول‌ها از مرکز جرم مشترک آنها تعریف می‌شود، که برای تجزیه و تحلیل فشردگی ترکیب کریستال عسل پس از شبیه‌سازی محاسبه می‌شود، بنابراین بینشی از ابعاد کلی ارائه می‌کند.

 از کریستال تشکیل شده نمودار Rg مولکول های قند کریستال در مقابل زمان در 300 K در شکل 4b نشان داده شده است . نوسان عمده در بین تمام مدل های شبیه سازی بین یک دوره زمانی 0 تا 1000 ps مشاهده شد ( شکل 4b ). که در شکل 4bمدل شبیه‌سازی با نسبت گلوکز/ فروکتوز 2.5:1 در زمان شبیه‌سازی زودتر نسبت به سایر مدل‌های شبیه‌سازی به حداقل مقدار Rg رسید که نشان‌دهنده بالاترین تمایل به تبلور بود.

 شبیه‌سازی گلوکز خالص کمترین مقدار Rg را در پایان شبیه‌سازی نشان داد که نشان‌دهنده فشردگی بیشتر کریستال گلوکز بود. این نتایج نشان داد که فرآیند تبلور عسل با گلوکز خالص متفاوت است، و همچنین از این فرضیه حمایت می‌کند که گلوکز سهم نسبتاً قابل‌توجهی در پایداری کریستال عسل دارد.

 SASA به عنوان سطح دو مولکولی قابل دسترسی برای مولکول های حلال تعریف می شود که برای ارزیابی انبساط نسبی ساختار کریستالی استفاده می شود. تغییر SASA تمام مدل های شبیه سازی با زمان در نشان داده شده است شکل 4c نشان داده شده است. کریستال گلوکز خالص (مدل d) کمترین مقدار SASA را در بین هر چهار مدل دارد.جدول 2و سپس کریستال با نسبت گلوکز/ فروکتوز در 2.5:1 (مدل c)، 2:1 (مدل b)، و 1:1 (مدل a) در عسل، که با نتایج Rg مطابقت داشت. از این رو می توان گفت که غلظت نسبتاً بالاتر گلوکز باعث تسهیل در تشکیل بلورهای پایدار در عسل می شود.

نتیجه‌گیری

تا آنجا که ما می‌دانیم، این اولین گزارشی بود که تبلور عسل را با شبیه‌سازی ملکولی پویا در سطح مولکولی عمیق مورد مطالعه قرار داد. مطالعه ما نشان داد که نسبت گلوکز به فروکتوز در بین اشکال مایع، کریستال و مخلوط عسل متفاوت است. شبیه‌سازی ملکولی پویا بیشتر نشان داد که تبلور عسل از نظر مورفولوژی و ثبات ساختاری با گلوکز خالص متفاوت است. نسبت گلوکز/فروکتوز در 2.5:1( به ترتیب 2.5 گلوکز بر روی یک فروکتوز) کریستال‌ها را در مدت زمان بسیار کوتاه‌تری نسبت به سایر مدل‌های شبیه‌سازی تشکیل می‌دهد و پایدارترین تبلور عسل بود، که احتمالاً بدان معنی است که نسبت 2.5:1 نسبت بحرانی تبلور عسل است. .