1. Введение

Обзор ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), изобретенная Кэри Муллисом, произвела революцию в молекулярной биологии. Этот метод является фундаментальным для амплификации in vitro определенных сегментов ДНК и играет решающую роль в генетических исследованиях, молекулярной диагностике заболеваний и многих других областях наук о жизни. Основная функция ПЦР заключается в получении очень большого количества копий определенного участка ДНК.

Введение в ПЦР в реальном времени (кПЦР)

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР в реальном времени), часто также называемая кПЦР или количественной ПЦР, представляет собой усовершенствованную форму ПЦР, которая позволяет отслеживать и количественно измерять амплификацию ДНК одновременно с протеканием реакции (т. е. в реальном времени) с использованием флуоресцентных сигналов. Эта особенность делает кПЦР мощным инструментом для количественных приложений, таких как анализ экспрессии генов и определение вирусной нагрузки.

В этой статье представлено всестороннее и подробное сравнение между обычной (или конечной) ПЦР и ПЦР в реальном времени (кПЦР). В связи с этим будут рассмотрены принципы, методология, стратегии обнаружения продуктов, возможности количественного определения, анализ данных, области применения, преимущества и недостатки, а также оборудование и расходные материалы, необходимые для обоих методов. Для большей ясности также будут объяснены связанные понятия, такие как ОТ-ПЦР и ОТ-кПЦР.

2. Обычная ПЦР: принципы и процесс

Фундаментальный принцип

Основной целью обычной ПЦР является экспоненциальная амплификация целевой последовательности ДНК, определяемой специфическими праймерами, посредством повторяющихся циклов температурных изменений. Этот метод в основном используется для получения больших количеств определенного фрагмента ДНК для последующего анализа.

Основные компоненты реакции

Для проведения реакции ПЦР необходимы следующие компоненты:

• Матричная ДНК (Template DNA): Образец ДНК, содержащий целевую последовательность, которую необходимо амплифицировать.
• Праймеры (Прямой и обратный): Короткие одноцепочечные последовательности ДНК (олигонуклеотиды, обычно длиной 20-25 нуклеотидов), комплементарные фланкирующим участкам целевой последовательности. Эти праймеры определяют фрагмент для амплификации и обеспечивают начальную точку (3'-ОН гидроксильную группу) для фермента полимеразы.
• ДНК-полимераза (DNA Polymerase): Термостабильный фермент (обычно Taq-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus), который синтезирует новые цепи ДНК. Термостабильность этого фермента имеет решающее значение для выдерживания многократных высокотемпературных этапов денатурации.
• Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTPs): Строительные блоки ДНК (включая dATP, dTTP, dCTP и dGTP), используемые полимеразой для построения новых цепей ДНК.
• Буфер (Buffer): Обеспечивает оптимальную химическую среду (pH и соответствующую концентрацию солей) для активности ДНК-полимеразы.
• Хлорид магния (MgCl2): Незаменимый кофактор для активности ДНК-полимеразы. Часто поставляется как часть буфера или мастер-микса.
• (Необязательно: Упоминание мастер-миксов) Готовые смеси (Master Mixes), содержащие полимеразу, dNTPs, буфер и MgCl2, широко используются для удобства и повышения воспроизводимости реакций.

Цикл ПЦР (термоциклирование)

Реакция ПЦР включает три повторяющихся этапа, контролируемых прибором, называемым термоциклером:

• Денатурация (Denaturation): Нагревание образца (например, до 95°C) для разделения двух цепей матричной ДНК и перевода их в одноцепочечное состояние.
• Отжиг (Annealing): Снижение температуры (например, до 55°C-65°C, в зависимости от температуры плавления или Tm праймеров) для связывания праймеров с их комплементарными последовательностями на одноцепочечной матричной ДНК. Температура плавления (Tm) праймеров является критическим фактором на этом этапе.
• Элонгация (Extension/Elongation): Повышение температуры (например, до 72°C, оптимальная температура для активности Taq-полимеразы) для синтеза ДНК-полимеразой новых цепей ДНК, начиная с праймеров.
• Повторение: Эти циклы повторяются 20-40 раз, что приводит к экспоненциальной амплификации (теоретически, удвоение продукта в каждом цикле) целевого фрагмента ДНК.

Обнаружение продукта (анализ по конечной точке)

В обычной ПЦР обнаружение продукта проводится после завершения термоциклирования.

• Электрофорез в геле (Gel Electrophoresis): Наиболее распространенный метод обнаружения продуктов ПЦР. Продукты ПЦР загружаются в агарозный гель, подвергаются воздействию электрического поля и разделяются по размеру. ДНК визуализируется под УФ-светом с использованием красителей, таких как бромистый этидий (EtBr) или более безопасных альтернатив (например, SYBR Safe, GelRed, DNA Safe Stain). Наличие полосы ожидаемого размера указывает на успешную амплификацию.
• Интерпретация результатов: Анализ геля подтверждает наличие или отсутствие и размер продукта. Интенсивность полосы может дать приблизительную, полуколичественную оценку количества продукта, но этот метод не очень надежен из-за эффекта плато. Наблюдение нескольких полос указывает на неспецифическую амплификацию или димеры праймеров.

3. ПЦР в реальном времени (кПЦР): принципы и процесс

Фундаментальный принцип

кПЦР отслеживает амплификацию ДНК во время каждого цикла с использованием детекции флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции пропорционально количеству образовавшегося продукта ПЦР. Эта особенность обеспечивает возможность количественного определения.

Основные компоненты реакции

Компоненты кПЦР аналогичны обычной ПЦР (матричная ДНК, праймеры, полимераза, dNTPs, буфер, MgCl2) плюс химическое вещество для детекции флуоресценции.

Химические реагенты для детекции флуоресценции

В кПЦР используются два основных типа химических реагентов для детекции:

• ДНК-связывающие красители (например, SYBR Green):
  • Механизм действия: Эти красители (например, SYBR Green I) излучают значительную флуоресценцию только при связывании с двуцепочечной ДНК (дцДНК). По мере накопления продукта дцДНК во время ПЦР интенсивность флуоресценции пропорционально возрастает.
  • Преимущества: Более простой дизайн анализа (требуются только праймеры), более низкая стоимость и возможность проведения анализа кривой плавления после ПЦР для проверки специфичности продукта.
  • Недостатки: Неспецифическое связывание – связывается с любой дцДНК, включая праймер-димеры и неспецифические продукты, что может привести к неточному количественному определению или ложноположительным результатам. Для подтверждения специфичности часто необходим анализ кривой плавления.
• Последовательность-специфические зонды (например, гидролизуемые зонды TaqMan®):
  • Механизм действия: Олигонуклеотидные зонды, которые специфически связываются с целевой последовательностью между сайтами связывания прямого и обратного праймеров. Эти зонды помечены репортерным флуоресцентным красителем на одном конце (например, 5'-конце) и гасителем на другом конце (например, 3'-конце). Пока зонд не поврежден, гаситель подавляет флуоресценцию репортера (из-за близости). Во время фазы элонгации 5'→3' экзонуклеазная активность полимеразы разрушает связанный зонд, отделяя репортер от гасителя. Это разделение приводит к увеличению флуоресценции репортера. Флуоресценция генерируется только в том случае, если целевая последовательность амплифицируется, а зонд связывается с ней и впоследствии расщепляется.
  • Преимущества: Высокая специфичность (сигнал генерируется только при амплификации целевого продукта), снижение ложноположительных результатов от неспецифических продуктов или праймер-димеров, возможность мультиплексирования (одновременное обнаружение нескольких мишеней в одной реакции с использованием зондов с разными репортерными красителями).
  • Недостатки: Более сложный дизайн анализа (требуется синтез специфического зонда), более высокая стоимость.
  • (Можно кратко упомянуть другие типы зондов, такие как Molecular Beacons или гибридизационные зонды, хотя TaqMan и SYBR Green являются наиболее распространенными).

Процесс кПЦР и сбор данных

Реакция кПЦР проводится в приборе для ПЦР в реальном времени (термоциклер для ПЦР в реальном времени), оснащенном оптической системой для возбуждения флуорофоров и детекции их излучения во время каждого цикла. Данные (интенсивность флуоресценции) собираются циклически.

Выходные данные: график амплификации и пороговый цикл (Ct/Cq)

• Описан типичный сигмоидальный график амплификации (флуоресценция в зависимости от номера цикла). Определены его фазы: базовая линия (ранние циклы, низкий сигнал/шум), экспоненциальная (логарифмически-линейная фаза, где флуоресценция увеличивается пропорционально продукту), линейная и плато.
• Порог (Threshold) определяется как произвольный уровень флуоресценции, установленный выше базового шума и в пределах экспоненциальной фазы.
• Ct (Cycle Threshold) или Cq (Quantification Cycle) определяется как (дробное) число циклов, при котором сигнал флуоресценции пересекает порог. Объясняется, что Ct/Cq является основной точкой данных, используемой для количественного определения.
• Объясняется обратная зависимость: меньшее значение Ct/Cq указывает на большее начальное количество целевой матрицы (амплификация пересекает порог раньше), тогда как большее значение Ct/Cq указывает на меньшее начальное количество.

4. Объяснение ключевых различий

• Время и характер обнаружения: Обнаружение по конечной точке (после ПЦР, качественный снимок) по сравнению с обнаружением в реальном времени (во время ПЦР, кинетический мониторинг).
• Возможность количественного определения: Преимущественно качественная или полуколичественная (ПЦР) по сравнению с высококоличественной (кПЦР). Объясняется причина, по которой кПЦР позволяет проводить количественное определение (измерение в экспоненциальной фазе).
• Выходные данные и интерпретация: Изображение геля (полосы, размер, приблизительная интенсивность) (ПЦР) по сравнению с графиком амплификации, значениями Ct/Cq, анализом кривой плавления (необязательно для SYBR) (кПЦР).
• Чувствительность и специфичность: кПЦР обычно обеспечивает более высокую чувствительность (обнаружение меньшего числа копий) и, особенно с зондами, более высокую специфичность. Чувствительность обычной ПЦР может быть высокой, но она склонна к обнаружению неспецифических продуктов.
• Обработка после ПЦР: Необходима для ПЦР (электрофорез в геле), в то время как в кПЦР обычно исключается (система с закрытой пробиркой снижает риск манипуляций и контаминации).

5. Сравнение областей применения

Применение обычной ПЦР

Основное внимание уделяется качественному или препаративному использованию:

• Обнаружение наличия/отсутствия (например, идентификация патогенов, базовая диагностика).
• Клонирование и субклонирование ДНК (амплификация фрагментов для вставки в векторы).
• Секвенирование (создание матрицы для реакций секвенирования).
• Генотипирование (например, обнаружение аллелей, скрининг трансгенных организмов).
• Сайт-направленный мутагенез (создание мутаций с помощью праймеров).
• ДНК-фингерпринтинг в криминалистике, установление отцовства.
• Анализ древней ДНК.
• Скрининг колоний.

Применение ПЦР в реальном времени (кПЦР)

Основное внимание уделяется количественному или высокочувствительному обнаружению:

• Анализ экспрессии генов (количественное определение уровней мРНК с помощью ОТ-кПЦР). Это одно из основных применений.
• Количественное определение вирусной нагрузки (например, ВИЧ, ВГВ, ВГС, SARS-CoV-2).
• Обнаружение и количественное определение патогенов (бактерий, вирусов, грибов, паразитов в клинических, пищевых, экологических образцах).
• Исследования рака (обнаружение мутаций, мониторинг минимальной остаточной болезни, фенотипирование рака).
• Генотипирование SNP и аллельная дискриминация.
• Анализ вариаций числа копий (CNV).
• Анализ микроРНК (miRNA).8
• Обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО).
• Анализ метилирования (например, метил-специфическая кПЦР).
• Количественное определение библиотек NGS.
• Валидация анализа / подтверждение результатов микрочипов.

6. Оборудование и расходные материалы

• Термоциклер:
  • Обычная ПЦР: Требуется стандартный термоциклер (прибор для ПЦР) для выполнения запрограммированных температурных циклов.
  • ПЦР в реальном времени: Требуется система для ПЦР в реальном времени (прибор для кПЦР), которая представляет собой термоциклер с интегрированным оптическим модулем (источник света, фильтры, детектор) для измерения флуоресценции в каждой лунке во время циклов.
• Расходные материалы (пластик):
  • Обычная ПЦР: Используются стандартные ПЦР-пробирки (0,2 мл или 0,5 мл), стрипы или 96/384-луночные планшеты из полипропилена. Прозрачность часто предпочтительна для визуального подтверждения работы с жидкостями.
  • ПЦР в реальном времени: Требуются оптические пробирки, стрипы или планшеты. Они предназначены для обеспечения эффективного возбуждения и детекции флуоресценции. Часто изготавливаются из белого или матового пластика для максимизации отражения сигнала и минимизации фона/перекрестных помех между лунками, или прозрачного для конкретных приборов/химических реагентов. Крышки планшетов также должны быть оптически прозрачными.42 Однородность и качество имеют решающее значение для получения стабильных результатов.
• Реагенты:
  • Обычная ПЦР: Матричная ДНК, праймеры, dNTPs, буфер, MgCl2, термостабильная полимераза (например, Taq). Распространены мастер-миксы.
  • ПЦР в реальном времени: Все реагенты для обычной ПЦР плюс флуоресцентный краситель (например, SYBR Green) или последовательность-специфические зонды (например, TaqMan). Часто используются специализированные мастер-миксы, содержащие флуоресцентный химический реагент и иногда оптимизированные полимеразы (например, Taq с «горячим стартом» для повышения специфичности). Может включать пассивный референсный краситель (например, ROX) для нормализации сигнала в некоторых системах.
• Другое оборудование (общее для обоих, но необходимое): Пипетки (с регулируемым объемом, многоканальные), наконечники для пипеток (рекомендуются фильтрующие наконечники для предотвращения контаминации), микроцентрифуга, вортекс-миксер, потенциально аппарат для электрофореза в геле (источник питания, камера для геля, УФ-трансиллюминатор — особенно для обычной ПЦР), компьютер для анализа (особенно кПЦР).

7. Преимущества и недостатки

Понимание сильных и слабых сторон каждого метода имеет решающее значение для выбора подходящего метода для исследовательского или диагностического применения. В таблице ниже обобщены эти моменты:

8. Заключение

Резюме основных различий

Фундаментальные различия между обычной ПЦР и ПЦР в реальном времени заключаются во времени и методе обнаружения продукта, возможности количественного определения, методе обнаружения (гель по сравнению с флуоресценцией) и его последствиях для обработки после ПЦР и риска контаминации. Обычная ПЦР — это метод конечной точки, в основном используемый для качественного или полуколичественного обнаружения и амплификации ДНК для последующих применений. В отличие от этого, ПЦR в реальном времени позволяет отслеживать амплификацию ДНК в режиме реального времени, обеспечивая точный количественный анализ.

Выбор правильного метода

Выбор между обычной ПЦР и кПЦР полностью зависит от экспериментального вопроса и его требований. Для базовой диагностики, клонирования или подготовки матрицы для секвенирования, где интересует только наличие или отсутствие или получение достаточного количества продукта, обычная ПЦР является экономически эффективным и адекватным методом. Однако для приложений, требующих точного количественного определения (например, анализ экспрессии генов, определение вирусной нагрузки), очень высокой чувствительности (например, обнаружение патогенов с низким числом копий или редких аллелей) или быстрого обнаружения, кПЦР является предпочтительным, а иногда и единственным возможным вариантом.

Взгляд в будущее

Технологии ПЦР продолжают развиваться. Например, цифровая ПЦР (цПЦР) появилась как метод с еще более высокой точностью количественного определения. Эти достижения демонстрируют динамизм области молекулярной биологии и постоянные усилия по разработке более точных и эффективных инструментов для исследований и диагностики. Правильное понимание различий и возможностей обычной ПЦР и ПЦР в реальном времени позволяет исследователям и клиницистам выбирать наиболее подходящий метод для достижения своих целей.

Применение ПЦР и ПЦР в реальном времени в контроле качества меда и пчеловодстве